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生科魏文胜课题组再次发文报道长非编码RNA的功

文章作者:国际学校 上传时间:2019-08-15

2018年11月5日,北京大学生命科学学院魏文胜课题组在Nature Biotechnology杂志在线发表了题为“Genome-wide screening for functional long noncoding RNAs in human cells by Cas9 targeting of splice sites”的研究论文。

基因的功能探索是生命科学研究的永恒主题。近几年以CRISPR-Cas9为代表的基因组编辑技术让直接在高等生物体内进行基因的功能筛选成为可能(Shalem, et al. Science 2014; Wang, et al. Science 2014; Koike-Yusa, et al. Nature Biotechnol 2014; Zhou et al, Nature 2014)。然而,蛋白编码基因仅占3%不到的基因组,研究者发现越来越多的非编码元件在生命活动中发挥极其重要的作用,比如非编码RNA、特别是长非编码RNA(lncRNA)的异常与癌症等很多疾病的发生发展相关。遗憾的是在已经注释的超过两万多lncRNA中,绝大部分长非编码RNA的功能未知,如何实现这类基因组元件的功能筛选已经成为当前的研究热点。

作为强大的基因编辑工具,CRISPR/Cas9系统能够在蛋白编码基因的外显子区域产生移码突变而彻底破坏蛋白表达及功能,这一特性被广泛应用于基因的大规模功能性筛选研究。人类基因组中除了蛋白编码基因,绝大多数区域为非编码序列。其中长链非编码RNA(lncRNA)已有上万个位点被注释,但是它们绝大多数功能未知,一些已知功能的lncRNA与癌症等很多疾病的发生发展密切相关。

对编码蛋白基因的敲除可以通过基因组编辑技术对目标区域实行单点切割、引入小片段插入或缺失(indels)以造成基因翻译读码框破坏,然而这一方法对于不依赖读码框的非编码元件作用有限。尽管有报道称用sgRNA文库通过饱和筛选研究单个或者少量基因的调控元件(Canver M.C. et al., Nature, 2015; Neville E. Sanjana et al., Science, 2016),但是在基因组水平上实现非编码元件的大规模筛选,依然缺乏有效的技术手段。

魏文胜课题组与合作者之前已率先建立了通过成对gRNA(pgRNA)在基因组中产生大片段删除的策略对lncRNA进行高通量功能性筛选(Zhu et al. Nature Biotechnol 2016)。后续又有报道通过CRISPRi(Liu et al. Science 2017)以及CRISPRa(Joung et al. Nature 2017)等方法进行lncRNA的高通量功能性筛选。这些方法在效率、质量(假阳性、假阴性)上各有欠缺:比如CRISPRi方法只能实现基因表达抑制而不能完全敲除;CRISPRa的方法只能上调基因表达,无法对基因不可或缺的作用实施筛选评估。大片段删除的策略由于步骤繁琐,也限制了其更大规模的应用。

北京大学生命科学学院、生物动态光学成像中心魏文胜研究组和哈佛大学公共卫生学院刘小乐(Shirley Liu)研究组合作,建立了paired-guide RNA(pgRNA)文库的构建方法,通过pgRNA引入的基因组大片段删除来破坏lncRNA表达及功能,并由慢病毒介导在多个癌细胞系中实现了功能筛选,从~12,000 pgRNA的CRISPR文库中成功鉴定出正向及负向调控癌细胞增殖的lncRNA。论文通过多种遗传学手段验证了候选lncRNA的功能,并通过生物信息分析和表达谱测序探究了其发挥作用的机制。有趣的是,通过分析候选lncRNA在肿瘤细胞发展不同阶段的表达水平,发现筛选得到的正向调控细胞增殖的lncRNA发挥致癌作用,而负向调控细胞增殖的lncRNA发挥抑癌作用。这是首次实现对于非编码元件的基因组水平的功能筛选,这一高通量技术平台的建立不仅有助于人们研究影响细胞增殖的非编码元件,还可以用于筛选发挥其他重要作用的非编码元件或者基因组中的功能未注释区域。

为了突破以上方法的局限,魏文胜课题组设计了新的筛选策略,构建了特异性靶向基因的剪接位点的新型CRISPR文库,以高通量的方式产生基因的外显子缺失或者内含子滞留。运用这一策略,实现了全基因组水平上对lncRNA功能的高效筛选。他们利用靶向10,996个lncRNA的特殊CRISPR文库,在慢性髓性白血病细胞K562中筛选并发现了230个lncRNA与细胞存活或增殖相关。研究团队在HeLa细胞和人B淋巴细胞GM12878中分别发现了115个、220个影响细胞存活与增殖的lncRNA,并通过进一步分析表明,lncRNA功能在不同细胞种类中具有显著异质性。这一新型高通量技术平台的建立,首次真正实现了从全基因组水平对长链非编码RNA进行基于完全敲除的高通量筛选,该方法学将为系统发现和解析lncRNA功能提供有效工具。

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CRISPR大片段DNA序列删除文库的构建和对lncRNA的高通量功能性筛选(a)pgRNA文库克隆构建方法(b)pgRNA文库筛选影响细胞增殖lncRNA的流程(c)负向筛选获得的候选基因(d)正向筛选获得的候选基因

a.真核生物(人)剪接位点区域的基因组序列特征和碱基特异性;b.靶向剪接位点的长非编码RNA的功能性筛选策略;c.K562细胞中影响细胞存活与增殖的lncRNA筛选结果

该研究于2016年10月31日在线发表于Nature BiotechnologyGenome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR–Cas9 library)。北京大学生命科学学院博士研究生朱诗优(PTN12级)和哈佛大学公共卫生学院博士后李炜为该论文共同第一作者,魏文胜和刘小乐教授为共同通讯作者。该研究项目的北大课题组得到了国家自然科学基金(重点及面上项目)、北大-清华生命科学联合中心、北京未来基因诊断高精尖创新中心的基金支持。

这项研究于11月5日在线发表于Nature Biotechnology(DOI: 10.1038/nbt.4283)。魏文胜课题组博士生刘莹(CLS 2014级)、曹中正(CLS 2015级),王轶楠博士(CLS 2013级)及博士后郭昱为该论文的共同第一作者。该研究得到国家自然科学基金重点项目、北京未来基因诊断高精尖创新中心和北大-清华生命科学联合中心的基金支持。

责编:白杨

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